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1、1、何謂流加發(fā)酵？ 答：所謂流加發(fā)酵，即補(bǔ)料分批發(fā)酵(Fed-batch fermentat i on),有時(shí)又稱 半連續(xù)培育或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新奇培 育基的發(fā)酵方法2、寫出Monod方程，并寫出其成立的條件和各參數(shù)的意義。 答：S 條件：溫度和pH恒定時(shí) / y,/ y. K+S ⑴菌體生長為均衡型非結(jié)構(gòu)生長; ⑵ 培育基中只有一種底物是生長限制性底物; ⑶菌體產(chǎn)率系數(shù)恒定參數(shù)意義：即iax稱為最大比生長速率(h-1) , Ks稱為半 飽和常數(shù)(g/L), S為限制性底物濃度。 3、細(xì)胞高密度培育過程存在的問題有哪些？其相應(yīng)解決措施有哪些？ 答

2、：?jiǎn)栴}：1 .產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的積累對(duì)生長的抑制氧的限制 2. HCDC中培育基粘度不斷增加，引起混合不充分C02和熱量的高釋放率 3. 措施1.掌握比生長速率在產(chǎn)生乙酸的臨界值以下選擇合適的培育基 2提高通氣速率和攪拌速度富氧空氣和純氧 在加壓環(huán)境下培育3有必要討論發(fā)酵罐中的攪拌模型，找到改善攪拌的方法。 4通過降低細(xì)胞比生長速率而局部的解決 把培育溫度從37℃降到26-30℃,會(huì)降低養(yǎng)分汲取和生長速度, 因此會(huì)削減有毒副產(chǎn)物和代謝產(chǎn)生的熱量。 降低溫度也能削減細(xì)胞對(duì)氧的需求。 降低重組細(xì)胞溫度也有可能削減包含體形式的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。 4、無反響掌握的流加策略有哪些？ 答

3、：開環(huán)（無反響）掌握恒速流加以預(yù)先打算的（恒定的）速率流加養(yǎng)分物質(zhì)，比 生長速率漸漸降低。 加速流加以漸漸增加的速率流加養(yǎng)分物質(zhì)?？裳a(bǔ)償一些比生長速率的降低。 指數(shù)流加——以指數(shù)的速率流加養(yǎng)分物質(zhì)。可得到恒定的比生 長速率。 閉環(huán)（反響）掌握即時(shí)DO——當(dāng)DO降低時(shí)補(bǔ)加養(yǎng)分物質(zhì)。 即時(shí)pH——主要碳源耗盡引起pH提升時(shí)補(bǔ)加養(yǎng)分物質(zhì)。 二氧化碳釋放率（CER） ——CER基本正比于碳源的消耗速度。 這一方法最為常常用于掌握比生長速率。 細(xì)胞濃度——養(yǎng)分物質(zhì)流加速率由細(xì)胞濃度打算。 底物濃度掌握——養(yǎng)分物質(zhì)流加速率直接由主要碳源的濃度 掌握5、何謂發(fā)酵產(chǎn)物的理論得率？可由哪些途徑計(jì)

4、算得到？ 答：假設(shè)發(fā)酵過程中完全沒有菌體生成，那么YP/S可達(dá)理論最高值，稱為理論代謝產(chǎn)物產(chǎn)率 論代謝產(chǎn)物產(chǎn)率 Y the or 1P/S 計(jì)算途徑（a）依據(jù)化學(xué)計(jì)量關(guān)系計(jì)算 例如，由葡萄糖、氮和氧生成谷氨酸的化學(xué)計(jì)量方程為： C6H]2O6 + NH3+1.5O2 f C5H9NO4 + CO2+3H2O yrtheor p/S=147/180=0.82（b）由生物化學(xué)計(jì)量關(guān)系計(jì)算 依據(jù)由底物生成目標(biāo)代謝產(chǎn)物的代謝途徑，進(jìn)行代謝過程中有關(guān)NAD（P） +和ATP等輔底物的物料衡算，結(jié)合化學(xué)計(jì)量關(guān)系可求出下式 1337-C6Hi2O6 + NH. + 2。2 f C5H“

5、NO, +-CO2+-H2O 由該反響式得y妨e” =（147X12）/（13X180） =0. 751P/S 由于NADPH和ADP的再生過程要消耗底物，故依這種方法求得的值要小于單 純依據(jù)化學(xué)計(jì)量關(guān)系求得的結(jié)果。 !!用生超客量式時(shí)，必「清晰招關(guān)的偉迪鎮(zhèn)徑女摭毒避分批1蝙輜轆續(xù)培育方式各自的狀質(zhì)嫩、滅菌等原因，非生產(chǎn)時(shí)間長 2.易轉(zhuǎn)產(chǎn)、生產(chǎn)靈活 2 .經(jīng)常滅菌會(huì)降低儀器壽命 3 .分批操作中某一階段可獲得高的3 .前培養(yǎng)和種子的花費(fèi)大轉(zhuǎn)化率 4 .發(fā)酵周期短，菌種退化率小 連續(xù)發(fā)酵~~1 .可實(shí)現(xiàn)有規(guī)律的機(jī)械、自動(dòng)化 5 .操作人員少 6 .反響器體積小、非生產(chǎn)時(shí)間少

6、 轉(zhuǎn)化率 7 .發(fā)酵周期短，菌種退化率小 連續(xù)發(fā)酵~~1 .可實(shí)現(xiàn)有規(guī)律的機(jī)械、自動(dòng)化 8 .操作人員少 9 .反響器體積小、非生產(chǎn)時(shí)間少 10 .產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 11 .操作人員接觸毒害物質(zhì)的可能性 小 12 .測(cè)量?jī)x器使用壽命長 流加發(fā)酵~~1.操作靈活 2 .染菌、退化的幾率小 3 .可獲得高的轉(zhuǎn)化率 4.需較多的操作人員或較多的自動(dòng)控制系統(tǒng) 1 .操作不靈活 2 .因操作條件不易改變，原料質(zhì)量必須穩(wěn)定 3 .假設(shè)采用連續(xù)滅菌，加上控制系統(tǒng)和自動(dòng)化 設(shè)備，投資較大 4 .必須不斷地排除一些非溶性的固型物 5 .易染菌，菌種易退化 1 .非生產(chǎn)時(shí)間長

7、2 .需較多的操作人員或計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng) 3 .操作人員接觸一些病原菌和有毒產(chǎn)品的可 能性大 4 .對(duì)發(fā)酵過程可實(shí)現(xiàn)優(yōu)化控制.因經(jīng)常滅菌會(huì)降低儀器使用壽命 7、用于發(fā)酵過程的優(yōu)化技術(shù)主要有哪些？試具體表達(dá)之。 答：基于微生物養(yǎng)分條件的發(fā)酵優(yōu)化基于微生物環(huán)境條件的發(fā)酵優(yōu)化 基于底物運(yùn)輸、生化反響、產(chǎn)物排出確定不同環(huán)境條件對(duì)微生物生長和代謝產(chǎn)物分布的影響——優(yōu)化微生物生長的物理 和化學(xué)環(huán)境保證微生物生特長于最適條件奠定基礎(chǔ) 基于微生物反響動(dòng)力學(xué)的發(fā)酵優(yōu)化1分析一發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(u, qp, qs)流變學(xué)參數(shù)的變化 特性——提出分階段掌握策略—— 目的——掌握環(huán)境條件在最適 合

8、細(xì)胞生長或最適合產(chǎn)物合成的水平2以數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)的優(yōu)化建立動(dòng)力學(xué)模型，求解參數(shù)并 評(píng)價(jià)其適用性對(duì)發(fā)酵進(jìn)程和產(chǎn)量指標(biāo)進(jìn)行猜想采納人工神 經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、專家系統(tǒng)、模糊規(guī)律掌握技術(shù)A——對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行在線狀態(tài)猜 測(cè)和模式識(shí)別B-一自適應(yīng)最優(yōu)化掌握系統(tǒng)的開發(fā)、計(jì)算機(jī)模擬和實(shí)際應(yīng)基于代謝通量分析的發(fā)酵優(yōu)化 參考的生化反響計(jì)量關(guān)系、代謝途徑、生理、特征，構(gòu)建、合 成不同產(chǎn)物的代謝網(wǎng)絡(luò)一一采用代謝通量分析方法,計(jì)算得出胞內(nèi)各條代 謝途徑的通量變化。分析不同發(fā)酵產(chǎn)品合成途徑中主要代謝節(jié)點(diǎn) 的性質(zhì)，結(jié)合發(fā)酵過程中胞內(nèi)能量代謝狀況，提出一系列發(fā)酵優(yōu)化策略基于環(huán)境脅迫發(fā)酵優(yōu)化 討論微生物的抗脅迫因子及其抗脅迫機(jī)制，

9、考察環(huán)境脅迫條 件下特定微生物蛋白轉(zhuǎn)錄和代謝途徑變化,采納不同環(huán)境脅迫手段或措施 對(duì)微生物的生長或代謝進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)微生物生長或大量合成目的產(chǎn)物。 基于輔因子調(diào)控的發(fā)酵優(yōu)化 討論輔因子形式及其濃度在物質(zhì)代謝和信號(hào)傳遞途徑中掌握代謝 流方向和流量安排的作用機(jī)制、物質(zhì)流和輔因子流的變化規(guī)律，對(duì)微生物 的生長或代謝進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)微生物合成目的產(chǎn)物的代謝流的最大化和快 速化。 系統(tǒng)優(yōu)化的發(fā)酵優(yōu)化：最終到達(dá)整體系統(tǒng)的優(yōu)化。 8、實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程優(yōu)化掌握的目標(biāo)有哪些？如何依據(jù)發(fā)酵過程的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)這些目 標(biāo)的相對(duì)統(tǒng)一？ 答：目標(biāo)；顯著提高發(fā)酵過程的經(jīng)濟(jì)性和科學(xué)性即到達(dá)高產(chǎn)量、高生產(chǎn)強(qiáng)度、凹 凸無轉(zhuǎn)化率

10、 實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的相對(duì)統(tǒng)一的方法：（第七題答案總結(jié)得到）9、一般狀況下，用于描述發(fā)酵過程參數(shù)變化的模型有哪些？各舉一例表示之。 答：生長偶聯(lián)型（乙醇發(fā)酵） rP=a，rx or QP = Yp]x , 〃 生長非偶聯(lián)型（次級(jí)代謝物）0 = /?Xy 。| qp = 0 = cons tan t 生長半偶聯(lián)型：（乳酸發(fā)酵,10、試舉一例說明如何優(yōu)化某一 10、試舉一例說明如何優(yōu)化某一 風(fēng)口于y 答：例子；1如何得到丙酮酸高產(chǎn)量發(fā)酵？一菌株選育和培育條件優(yōu)化選育自身不能合成維生素的酵母（維生素缺陷型）掌握培育基 中維生素濃度2如何提高丙酮酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度?

11、 2如何提高丙酮酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度? 分階段溶氧掌握 高溶氧下，丙酮酸轉(zhuǎn)化率較高，但生產(chǎn)強(qiáng)度（葡萄糖消耗速度）（PE到 Pyr的通量增加了 20%,丙酮酸進(jìn)一步代謝的通量下降了 63. 3% 低溶氧下，葡萄糖消耗速度加快，然而丙酮酸產(chǎn)率卻明顯下降（NADHATP 的增高） 最終得到：采納單一高或低供氧模式，不能同時(shí)到達(dá)高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強(qiáng)度! 前16 h較高溶氧有利于碳流合成細(xì)胞；16h后耗氧速率恒定, 碳流轉(zhuǎn)向合成丙酮酸確定分階段供氧模式：發(fā)酵0-16 h掌握 kLa 為 450 h-1, 16 h 后將 kLa 降低至 200 h-13如何使酵母從積累丙酮酸轉(zhuǎn)向積累a

12、-酮戊二酸輔因子調(diào)控 先翻開丙酮酸脫氫酶系（PDH）途徑然后翻開丙酮酸覆化酶（PC）途徑4從積累丙酮酸轉(zhuǎn)向積累a-酮戊二酸 添加Ca2+離子，PC活性受Ca2+所激活——同時(shí)翻開PDH和PC途徑5提高耐鹽力量促進(jìn)丙酮酸代謝 細(xì)胞生長和丙酮酸積累隨著滲透壓的提升而降低；采納pH掌握的 連續(xù)培育方法，以高濃度氯化鈉為選擇性壓力獲得突變株RS23 從而使丙酮酸的產(chǎn)量提高11、代謝工程的定義是什么？其主要的討論方法和應(yīng)用領(lǐng)域是什么？ 答：定義：一般定義：通過某些特定生化反響的修飾來定向改善細(xì)胞的特性或運(yùn)用重組DNA技術(shù)來制造新的化合物 具體定義：代謝工程是應(yīng)用重組DNA技術(shù)和應(yīng)用分析生物學(xué)相

13、關(guān)的遺 傳學(xué)手段進(jìn)行有精確目標(biāo)的基因操作，以轉(zhuǎn)變微生物原有的調(diào)整系統(tǒng) （酶的功能和輸送體系的功能、甚至產(chǎn)能系統(tǒng)的功能），通過有目的 地對(duì)細(xì)胞代謝進(jìn)行修飾（功利性修飾）以轉(zhuǎn)變細(xì)胞某些方面的代謝活 性的整套工作（包括代謝分析、代謝設(shè)計(jì)、遺傳操作、目的代謝產(chǎn)物 的實(shí)現(xiàn)），從而到達(dá)實(shí)現(xiàn)目的代謝活性產(chǎn)物的提高這一預(yù)期目標(biāo)的一 個(gè)嶄新的領(lǐng)域。 討論方法：（1）代謝工程注意酶學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)、分子反響動(dòng)力學(xué)以及現(xiàn)代 數(shù)學(xué)的理論及技術(shù)為討論手段，在細(xì)胞水平上說明代謝途徑與代謝網(wǎng)絡(luò) 之間局部與整體的關(guān)系、胞內(nèi)代謝過程與胞外物質(zhì)運(yùn)輸之間的偶聯(lián)以及 代謝流流向與掌握的機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上通過工程和工藝操作到達(dá)優(yōu)化

14、細(xì)胞性能的目的。 （2）代謝工程中的遺傳手段可以采納基因工程技術(shù)，也可以采納 常規(guī)誘變育種技術(shù)，但前者有機(jī)會(huì)引進(jìn)外源基因和外源調(diào)整因子，這同 傳統(tǒng)的改良菌種的遺傳方法不同。 （3 ）代謝工程通過對(duì)特定的生化反響的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行修飾或用重 組DNA技術(shù)導(dǎo)入新的生化反響來改進(jìn)蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。 應(yīng)用領(lǐng)域：①發(fā)酵工業(yè)方面，用于提高微生物合成自然 目標(biāo)產(chǎn)物的得 率和生產(chǎn)力量；②擴(kuò)大微底物采用范圍； ③生產(chǎn)原來不存在的新物質(zhì)；④提高菌體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力量，如耐受缺氧、改善同化氮的 力量或抑制性物質(zhì)的力量； ⑤阻斷或降低副產(chǎn)物的生成；⑥在環(huán)境工程方面降解有害廢棄物及有害物質(zhì)； ⑦制備手性化合物，作

15、為醫(yī)藥中間體；⑧在醫(yī)療方面，用于整體器官和組織的代謝過程分析，用于 鑒定基因治療或養(yǎng)分掌握疾病的目標(biāo);⑨信息傳導(dǎo)途徑方面，進(jìn)行信息流分析，為了治療疾病而進(jìn) 行基因表達(dá)的分析和調(diào)整，以及說明信息流的相互作用 和掌握； ⑩異源蛋白的生產(chǎn)。 12、何為系統(tǒng)優(yōu)化技術(shù)？試舉一例說明之。 答：系統(tǒng)：系統(tǒng)是同類或相關(guān)事物按肯定的內(nèi)在聯(lián)系組成的整體， 優(yōu)化技術(shù)：采納定性或定量的模型優(yōu)化技術(shù)，使系統(tǒng)整體目標(biāo)最優(yōu) 例子：ATP再生系統(tǒng)及其在谷胱甘肽生物合成中的應(yīng)用 1、問題的來源 ? 固定化細(xì)胞和酶在工業(yè)生物技術(shù)中的廣泛應(yīng)用 ? 局限于簡(jiǎn)潔的酶催化反響 多酶反響的障礙在于缺乏輔因子(如ATP、N

16、AD、輔酶A)的再生 系統(tǒng)。 2. ATP再生系統(tǒng)的定義及分類定義：一個(gè)需要ATP的生物酶反響系統(tǒng)與 一個(gè)ATP生物合成系統(tǒng)所構(gòu)成的耦合系統(tǒng)3兩種系統(tǒng)的不同之處 自耦合ATP再生系統(tǒng)只用到一種微生物，故該菌中必需 同時(shí)具有需要ATP 的生物合成反響的酶活性和再生ATP的酶活性? 種間耦合ATP再生系統(tǒng)采納不同的微生物，一種作為ATP合成活性的供 體，另一種作為與此相偶聯(lián)的生物合成酶活性的供體 ? 以E.coli作為合成酶活性的受體菌和具有較強(qiáng)ATP生物合成活性的產(chǎn) 氨短桿菌或面包酵母組合而成的種間耦合反響系統(tǒng). ATP再生系統(tǒng)存在的問題 (1)除了合成產(chǎn)物所需的關(guān)鍵酶以外，細(xì)胞內(nèi)還有

17、很多酶，其中一些 具有分解活性，能將反響的底物和預(yù)定的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物 (2)微生物細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我保護(hù)功能。作為滲透屏障的細(xì)胞膜可 防止胞內(nèi)物質(zhì)滲出。但當(dāng)細(xì)胞用作酶源時(shí)，這種屏障就會(huì)阻礙底物 和產(chǎn)物進(jìn)出細(xì)胞.解決ATP再生系統(tǒng)存在問題的方法 (1)抑制副反響的方法 對(duì)于具有分解、轉(zhuǎn)移底物或產(chǎn)物為副產(chǎn)物的酶，可通過選育 缺失該酶活性的突變株，或優(yōu)化反響條件使副產(chǎn)物的形成降 低到最小的限度(2)提高膜通透性的方法 干燥細(xì)胞或用溶劑、外表活性劑處理細(xì)胞都可以提高細(xì)胞膜 的通透性13、何為輔因子工程？常見的輔因子有哪一些？其主要的調(diào)控作用方式有哪些？ 答： 什么是輔因子工程? 輔因

18、子工程是采用分子生物學(xué)的手段,改造細(xì)胞內(nèi)輔因子的再 生途徑，改變微生物細(xì)胞內(nèi)輔因子的形式和濃度，定向改變和 優(yōu)化微生物細(xì)胞代謝功能，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝流最大化、快速化地 導(dǎo)向目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成。 輔因子工程所涉及到的輔因子有:ATP/ADP/AMP、 NADH/NAD+、NADPH/NADP+、乙酰輔酶A及其衍生物、維 生素和微量元素。其中，NADH/NAD+作為重要的輔因子全程 參與了微生物細(xì)胞內(nèi)300多個(gè)氧化還原反響。 輔因子調(diào)控的作用方式1能荷調(diào)整：ATP ADP AMP對(duì)一些酶進(jìn)行變構(gòu)調(diào)整，能荷水平對(duì)EMP TCA氧化磷酸 化調(diào)整能荷高抑制上述代謝能荷低促進(jìn)上述代謝，促進(jìn)ATP生成2

19、 NADH/NAD+調(diào)整：能量代謝、氧化還原反響； 碳代謝流線粒體 3金屬離子調(diào)整：金屬離子可作為很多酶的激活劑14、何為初級(jí)代謝？何為次級(jí)代謝？試各舉一例說明。 答：初級(jí)代謝產(chǎn)物定義為“在細(xì)胞生長所需要的反響中形成的產(chǎn)物”可能比擬準(zhǔn)確一^些（ 次級(jí)代謝產(chǎn)物定義為“在那些對(duì)于細(xì)胞生長不重要的反響中形成的產(chǎn)物例子 初級(jí)代謝產(chǎn)物次級(jí)代謝產(chǎn)物 青霉素~~乙醇頭胞菌素 C02四環(huán)素乙酸鏈霉素 檸檬酸短菌肽谷氨酸氯霉素 賴氨酸卡那霉素葡萄糖酸灰黃霉素 核黃素赤霉素 15、何為微生物生長的Crabtree效應(yīng)？ ? 答：Crabtree效應(yīng)是指，好氧條件下，酵母（釀酒酵母）在高濃度 的初始葡萄糖濃度下，會(huì)通過糖酵解途徑代謝葡萄糖而生成乙醇。而不是 通過三期酸循環(huán)參加生長和代謝。一般酵母在厭氧條件下才會(huì)走糖酵解途 徑。 ?葡萄糖濃度的增加會(huì)加速糖酵解，通過底物水平磷酸化形成肯定數(shù)量ATP。 這樣可降低對(duì)通過TCA循環(huán)和電子傳遞鏈的氧化水平磷酸化的需求，以降 低氧的需求。